结核分枝杆菌(Mtb) 每年导致 160 万人死亡。活动性结核病与中性粒细胞驱动的 I 型干扰素 (IFN) 特征相关，但结核病发病机制的细胞机制仍知之甚少。
研究发现，间质巨噬细胞（IM）和浆细胞样树突状细胞（pDC）是小鼠和非人类灵长类动物 Mtb 感染期间 I 型 IFN 的主要产生者，并且 pDC 位于人类 Mtb 肉芽肿附近。pDC 的耗竭减少了 Mtb 负担，表明 pDC 与结核病发病机制有关。在 IFN 驱动的疾病期间，科学家们观察到大量含有 DNA 的中性粒细胞胞外陷阱 (NET)，被描述为激活 pDC。I 型 IFN 受体的细胞类型特异性破坏表明 IFN 作用于 IM 来抑制 Mtb 控制。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 表明 I 型 IFN 应答细胞对 IFNγ 的应答存在缺陷，IFNγ 是一种对 Mtb 控制至关重要的细胞因子。学者认为，pDC 衍生的 I 型 IFN 作用于 IM，允许细菌复制，进一步推动中性粒细胞募集和活动性结核病。
结核病病原体结核分枝杆菌(Mtb) 在 2021 年导致 160 万人死亡。治疗需要 4 至 6 个月的抗生素疗程，对于日益流行的多重耐药菌株则需要长达 2 年的疗程。此外，唯一被批准的结核分枝杆菌疫苗对成人的疗效存在差异或无效。
结核病的病理生理学仍然知之甚少。小鼠模型已被用来发现大多数已知控制人类结核病的宿主因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素（IFN）-γ。
然而，小鼠模型因未能很好地概括人类疾病的关键方面而受到批评。在人类中，活动性结核病与 I 型干扰素的诱导重复相关，细胞因子家族，包括 IFNβ 和多种 IFNα 亚型。I 型干扰素通过 I 型干扰素受体 (IFNAR) 发出信号，引发抗病毒反应，该反应重叠但不足以重现 IFNγ 引发的保护性抗结核分枝杆菌反应。I 型干扰素会加剧人类结核病的证据来自于对病毒感染与更严重的结核分枝杆菌感染结果相关的观察。例如，流感感染与肺结核患者死亡风险增加相关，而携带巨细胞病毒的婴儿患结核病的风险增加。
IFNAR的部分功能丧失突变与人类Mtb 耐药性相关，这一发现也支持了 I 型 IFN 在驱动人类结核病中的因果作用。
I 型 IFN 如何驱动人类 Mtb 进展尚不清楚，但一种机制可能涉及感染过程中关键的保护性 IFNγ 反应的拮抗作用。
小鼠能够模拟人类中病毒诱导的 Mtb 易感性，并确定 I 型 IFN 与 Mtb 控制丧失之间的因果关系。慢性淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）、急性LCMV、小鼠肺炎病毒和甲型流感病毒都会加剧结核感染。
然而，共感染研究使得确定 Mtb 易感性背后的细胞机制变得具有挑战性，因为 I 型 IFNAR 阻断等干扰同时影响病毒和细菌控制。因此，研究 I 型 IFN 驱动的 Mtb 易感性的理想平台是小鼠模型，其中 Mtb 感染本身足以引发在活动性结核病患者中观察到的加剧的 I 型 IFN 反应。然而，最常用的 Mtb 感染模型 C57BL/6 (B6) 小鼠对 Mtb 感染产生较弱的 I 型 IFN 应答；事实上，未操作的 B6 小鼠中Ifnar1 的缺失并不能始终影响 Mtb 的肺负荷。
研究人员通过向 B6 小鼠鼻内注射 PolyI:C（一种 IFN 诱导病毒模拟物）解决了这个问题。
此类研究证明了 I 型 IFN 与小鼠 Mtb 易感性之间令人信服的因果关系，并表明 I 型 IFN 的主要有害作用是损害 Mtb 的白细胞介素 1 依赖性控制。
尽管取得了这些进展，但破译 I 型 IFN 对细菌控制产生有害影响的细胞机制仍然具有挑战性，特别是鉴定产生或响应 I 型 IFN 以介导 Mtb 易感性所需的细胞仍然未知。
与 B6 小鼠不同，C3H 和 129 小鼠表现出 I 型 IFN 驱动的对 Mtb 的易感性，但这些小鼠品系的遗传工具有限，使得机制研究变得困难。我们最近发现，同源B6小鼠具有来自C3H小鼠（即B6.Sst1S小鼠）的“结核病超级易感性1”区域由于 I 型 IFN 反应强烈，因此更容易受到 Mtb 感染（与同基因 B6 小鼠相比）。Ifnar1缺失完全挽救了 B6 增强的易感性。Sst1S小鼠在早期时间点并增加存活率。
我们进一步确定Sp140是Sst1遗传区间内控制 Mtb 易感性的基因，并证实Sp140−/−小鼠的早期 Mtb 易感性也可以通过Ifnar1缺失得到挽救。我们的Sp140−/−小鼠是在纯 C57BL/6J 背景下生成的，从而能够使用现有的遗传工具来剖析结核病发病机制。
在这项研究中，我们利用Sp140−/−小鼠来确定 I 型 IFN 驱动的 Mtb 易感性的细胞机制。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 确定间质巨噬细胞 (IM) 是 I 型干扰素的主要产生者。I 型 IFN 产生的敏感基因报告证实了 scRNA-seq 的发现，并揭示了浆细胞样树突状细胞 (pDC) 是 Mtb 感染期间 I 型 IFN 的另一个来源。pDC 产生的 I 型干扰素似乎会导致疾病，因为 pDC 耗竭挽救了Sp140−/−小鼠的易感性增强。Sp140-/−小鼠中细菌控制的丧失导致中性粒细胞大量涌入，并大量产生富含 DNA 的中性粒细胞胞外陷阱 (NET)，这种配体被描述为促进 pDC 产生 I 型干扰素。
我们开发了转录特征来区分 I 型 IFN 引起的反应与 IFNγ 引起的反应。将这些特征应用于我们的 scRNA-seq 数据表明，肺部感染 Mtb 的 I 型 IFN 反应性 IM 具有受损的 IFNγ 反应。
细胞类型特异性删除Ifnar1证实 I 型 IFN 通过作用于 IM 来赋予易感性。我们的研究结果提出了一种结核病发病机制模型，其中 I 型 IFN 可能通过损害 IFNγ 反应导致细菌控制最初丧失，进而启动 pDC 产生 NET 和表达 I 型 IFN 的正反馈循环，从而导致不受控制的细菌复制和活动性结核病。
为了进一步表征 B6 和Sp140−/−小鼠中 Mtb 感染的骨髓细胞，我们在感染 25 天后对来自 Mtb 感染或未感染肺部的骨髓细胞进行了 scRNA-seq。在本实验中，CD64+和 Ly6G+细胞经过磁性富集、分选纯化，并使用 10× Genomics 平台进行文库生成处理（图 2A）。来自 Mtb 感染小鼠的感染和未感染（旁观者）细胞被分别分类和条形码。通过测序 (CITE-seq) 对转录组和表位进行细胞索引，同时测量选定谱系标记的 mRNA 转录本和蛋白质表达，从而可以进行加权最近邻 (WNN) 分析，对 mRNA 和蛋白质表达进行细胞聚类，并使用 WNN 均匀流形近似和用于数据可视化的投影（wnnUMAP）减少。生成的数据集由 6,604 个 B6 和 13,668 个Sp140−/−细胞组成，几乎全部由骨髓细胞组成（图 2B）。每个簇都在两个数据集中表示；然而，一些簇的比例在基因型之间发生变化。最值得注意的是， Sp140−/−小鼠中 IFN 刺激基因 (ISG)+IM 与 ISG−IM的比率较高，正如该品系中 I 型 IFN 反应加剧所预期的那样（图 2B）。当比较来自初始肺和旁观者的细胞以及来自受 Mtb 感染的肺的受 Mtb 感染的细胞时，可以看到成分的最大变化（图 2B）。例如，AM 在初始肺中相对丰富，但在感染后 25 天的 Mtb 感染细胞中很少见，这也通过流式细胞术观察到（图1F 和2B）。未感染小鼠的B6 和Sp140−/−骨髓细胞在转录上高度相似，证实 B6 和Sp140−/−小鼠中 I 型 IFN 驱动的变化发生在 Mtb 感染后。
为了确定 I 型 IFN 驱动的 Mtb 易感性的细胞机制，我们首先试图鉴定产生 I 型 IFN 的细胞。一般来说，我们的 scRNA-seq 分析显示，很少有细胞呈Ifnb1阳性，这可能反映了 scRNA-seq 缺乏敏感性，和/或该基因的瞬时和随机表达模式（图 3A）。Mtb 感染导致受感染和旁观者单核吞噬细胞中Ifnb1的表达增加，与单核细胞相比，IM 产生的Ifnb1略有偏差，而 AM 不产生（图 3A）。尽管B6 和Sp140−/−细胞之间产生Ifnb1 的细胞类型没有重大差异，但表达Ifnb1的Sp140−/−细胞的数量和频率更高（图 3B）。此外，Sp140-/−小鼠中表达Ifnb1 的细胞倾向于比 B6 细胞更高的Ifnb1单细胞表达（图 3C）。先前对非人类灵长类动物感染 Mtb 和幼稚肺部的 scRNA-seq 研究在很大程度上反映了我们在小鼠身上的发现。我们对这些数据的分析表明，IMs也是患有活动性结核病的非人灵长类动物中主要的IFNB1表达细胞，并且IMs在幼稚或潜伏感染的肺部中不表达IFNB1（图3D）。这些结果表明，小鼠忠实地再现了在非人类灵长类动物中观察到的 Mtb 诱导的 I 型 IFN 产生。
scRNA-seq 数据集中鉴定的 I 型 IFN 产生者使用称为 I-Tomcat 小鼠的Ifnb1基因报告基因进行了验证，该基因报告基因表达Ifnb1下游的 TdTomato 和 Cre （图 3E 和S3）。尽管在用polyI:C进行体外刺激后， TdTomato表达足以识别骨髓源性巨噬细胞的Ifnb1表达（图S3），但在Mtb感染后25天未检测到TdTomato+细胞（图3F）。通过检查感染后 19 天的较早时间点或通过门控特定免疫群体（例如 IM），I-Tomcat 纯合小鼠中的 TdTomato 检测没有得到改善（图 S3）。尽管 I 型 IFN 会导致Sp140−/−小鼠的 Mtb 易感性，但尚不清楚 I 型 IFN 何时产生（图 1A）。I 型干扰素的产生可能是一个早期和/或短暂的事件，通过分析单个时间点可能会错过这一事件。为了解决这个问题，我们将 I-Tomcat 小鼠与 Ai6 Cre 报告小鼠 (I-Tomcat Ai6) 在 B6 和Sp140−/−背景上杂交（图 3E）。
在这些小鼠中，任何曾经表达Ifnb1 的细胞都将组成型表达 ZsGreen。感染 Mtb 的 I-Tomcat Ai6 小鼠含有报告者阳性骨髓细胞，并且在预期不表达Ifnb1的细胞群中检测到低背景（例如，约 0.1% 的 T 细胞是 Ai6+）（图 3G）。与 scRNA-seq 分析一致，IM 和单核细胞是B6 和Sp140−/−小鼠中主要的Ifnb1表达细胞（图 3H和S3）。除了证实 scRNA-seq 数据外，I-Tomcat 小鼠还确定 pDC 是主要的 I 型 IFN 产生细胞群。肺 pDC 是非常罕见的 CD64-/Ly6G-细胞，因此没有出现在我们的 scRNA-seq 数据集中。然而，尽管 pDC 很稀缺，但它们在每个细胞上都是 I 型 IFN 的极其强大的生产者。
在确定 pDC、IM 和单核细胞是 Mtb 感染期间产生 I 型 IFN 的主要细胞后，我们接下来试图确定对 I 型 IFN 做出反应的细胞。正如预期的那样，所有肺骨髓细胞均一致表达 IFNAR，因此对于识别 IFN 应答细胞没有提供信息（图 7A）。
然而，比较 B6 和Sp140−/−中性粒细胞和 IM 中差异表达的基因表明，与B6 动物相比，Sp140−/−细胞中 ISG 明显诱导（图 7B）。一个主要的并发症是，许多由 I 型 IFN 诱导的基因也由 II 型 IFN (IFNγ) 诱导，并且大多数现有研究没有区分两者。因此，我们试图开发 I 型 IFN 特异性和 IFNγ 特异性转录特征。使用IFNγ、IFNβ、TNF、转化生长因子-β或不刺激的人巨噬细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞的RNA测序分析来定义细胞因子诱导的基因（图S5和S6）。
在人类和小鼠巨噬细胞中，I 型或 II 型干扰素优先上调类似的基因家族。I 型或 II 型 IFN 特征中包含的基因并未被一组其他细胞因子强烈诱导（图 S5）。接下来，我们将小鼠基因特征应用于小鼠肺骨髓 scRNA-seq 数据集。初始小鼠中特征表达的强度被用作将细胞分类为对 IFNγ 或 I 型 IFN 作出反应的阈值（图 S6）。正如预期的那样，初始小鼠几乎没有细胞对任一细胞因子做出反应，而旁观者和结核分枝杆菌感染的细胞对 I 型和/或 II 型 IFN 反应强烈（图7C和S6）。有趣的是，尽管单核细胞和 AM 对 IFNγ 有反应，但 I 型 IFN 反应仅限于 IM 和中性粒细胞。这些细胞定位的差异可能可以解释它们细胞因子反应性的差异。正如预期的那样，相对于来自 B6 肺的细胞，来自Sp140−/−小鼠的 Mtb 感染的中性粒细胞和 IM表现出 I 型 IFN 信号显着增加（图 7D）。
相对于 B6 小鼠，Sp140−/−小鼠中 Mtb 感染的 IM 中 IFNγ 信号的减少与Sp140−/−中这些细胞上 IFNγ 受体 1 表达的减少相关（图 S7）。IFNγ受体1表达的减少还与I型ISG的增加和II型ISG的减少相关（图S7）。由于 IFNγ 对于 Mtb 控制至关重要，因此这些结果表明，I 型 IFN 至少在一定程度上通过打开无法对 IFNγ 做出反应的易感 IM 的利基来损害 Mtb 控制。
总而言之，我们的结果确定了在 IFN 驱动的结核病期间产生 I 型 IFN 并对其做出反应的细胞类型。我们认为，除了之前描述的抑制 IL-1 信号传导的作用之外，I 型 IFN 还会损害对 IFNγ 的反应性，导致细菌控制的最初丧失。然后细菌复制导致患病组织内中性粒细胞流入和 NET 产生。富含 DNA 的 NET 可能是 pDC 中内体 TLR 感知的细胞外衍生配体的来源之一，尽管细胞 RNA 或细菌 DNA 可能是其他来源。pDC 的激活导致每个细胞产生非常强劲的 I 型 IFN，我们认为这会在正反馈循环中发挥作用，进一步拮抗 IFNγ 信号传导并降低 IM 限制 Mtb 生长的能力。鉴于我们的结果与恒河猴和人类携带活跃结核分枝杆菌的研究结果之间的相关性，我们相信我们提出的 I 型干扰素驱动的结核分枝杆菌控制丧失的机制在物种间是保守的。这些发现为开发针对 NET 产生或 pDC 功能的疗法打开了大门，作为治疗活动性 Mtb 感染的宿主导向策略。
尽管我们发现 NET 的形成与 I 型 IFN 驱动的 Mtb 易感性之间存在很强的相关性，但当前的研究并未直接测试 NET 在此反应中的贡献。此外，这项研究提供的数据表明，I 型 IFN 信号传导与 Mtb 感染期间 IM 中 II 型 IFN 信号传导的丧失相关，但没有直接检查 Sp140 −/− 小鼠中携带 Mtb 的 IM 是否无法控制 Mtb感染，因为对 IFNγ 缺乏反应。我们还将研究限制在感染后约 25 天，这是 Mtb 感染的早期时间点。I 型 IFN 的细胞来源和靶标可能在感染的后期时间点转移到其他细胞类型。
