小于400 nm的光线称为紫外线；大于750nm的光线称为红外线。
物质对光线具有选择性的吸收作用，每种物质都具有其特征性的吸收光谱
光谱记录的就是电磁辐射的波长与其发射或者吸收的强度。
（1）发射光谱：指构成物质的分子、原子或者离子受到热能、电能或者化学能的激发而产生的光谱。
（2）吸收光谱：指物质吸收光源辐射所产生的光谱。紫外光谱就是典型的吸收光谱。所有利用光谱记录吸收值的实验方法都可认为是分光光度法。这是利用物质所特有的吸收光谱鉴定物质或者测定其含量、性质、组成和结构的一种技术。在分光光度法中，物质吸收光线的能力遵循朗伯比尔定律
在上面的公式中，A为物质在特定波长下的光吸收值，e是待测物质的摩尔吸收系数，l是光程长度；C是待测物质的浓度。
属于吸收光谱，常用的紫外光谱一般包括紫外和可见两个光区，波长在200~800nm。这种吸收光谱是由于价电子和分子轨道上的电子在电子能级上的跃迁所产生的，具有不同分子结构的各种物质有对电磁辐射选择性吸收的特性。生物大分子大部分都具有生色团和助色团，因此都具有紫外特征吸收。而大多数的定量实验或酶活性鉴定、产物的生成都伴随了生色反应。因此可以借助紫外可见吸收光谱进行定量检测。
大部分紫外分光检测仪器都由光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统等部分组成
（1） 吸收池又称比色皿，主要用于盛放分析试样，传统的比色皿一般由石英和玻璃两种材料制成。玻璃比色皿只适用于可见光区，而石英比色皿适用于紫外及可见光区。现在有一次性的塑料比色皿和塑料酶标板同样可以用于紫外吸收光谱的检测，甚至现在一些紫外检测仪器根本不需要比色皿，可以直接加样到检测区实现检测。
不管使用哪一种比色皿，我们都要保证光程长度精确固定以及材料本身对吸光影响较少。
（2）主要的紫外分光光度测定法：①标准比较法 ②标准曲线法
①标准比较法：在相同的条件下，配制标准溶液和待测样品溶液，并测定它们的光吸收值，通过对两者光吸收的比较，可以求出待测物品的溶液的浓度。
②标准曲线法是事先制作一条标准曲线，计算得到线性拟合方程，再根据待测样品的光吸收值，求出待测样品溶液的浓度。
（3）常见的紫外吸收光谱检测仪器
无论哪一种仪器，在使用前一定要了解光源穿过溶液的方向，因为这影响了光程长度，比如紫外可见光吸收光谱仪和紫外可见分光光度计的光束一般是以水平方向穿过溶液的，那么光程长度与比色皿的宽度是一致的。而超微量紫外检测器和酶标仪的光束一般是以垂直方向穿过溶液的，光程长度与溶液高度一致。
（4）紫外检测注意事项
①避免光路通道污染，具体来说在每次检测前应该使用洁净的比色皿或微孔板，并且将比色皿光面或者微孔底面擦拭干净；
②根据检测物质选择适合的比色皿；
③避免使用混浊样品、雾样或混浊样品会由于散射光线而使读数产生较大的误差，即便是肉眼不可见的轻微混浊也会干扰结果，因此在检测前通过离心等方式减少混浊。紫外分光光谱及其相关仪器可用于生物大分子和化学小分子的定量及定性测定、酶活力测定及酶动力学研究、分间相互作用研究、酶联免疫法实验、细胞增殖实验、细胞毒性实验等等，经过紫外检测后，我们得到的结果一般有两种形式：①第一种形式：单波长点的光吸收值，得到的光吸收值可以进一步用于标准曲线的绘制、浓度的计算和产物生成量的计算等等；②第二种形式：是检测波长范围内的吸收曲线，比如下面的紫外-可见吸收光谱图，我们一般可以根据吸收峰所在的位置、吸收峰形状和数量等信息进行进一步结果分析。
（1）原理：在室温下绝大部分物质分子中的外电层电子处于能量最低态（基态），在光照射时，物质分子吸收了某种波长的光后，处于基态的电子就有可能被激发而跃迁到能量较高的激发态上，处于激发态的电子是不稳定的，它们会自动再回到较低能级或基态。在整个跃迁过程中，分子将多余的能量以电磁波的形式辐射出来。这种发光随着激发光的消失而立即消失即为荧光。我们称吸收的光为激发光，而发射出来的光为发射光。荧光光谱可利用物质吸收短波的光能后发射出较长波长光的特征光谱这一性质对物质进行定性或者定量分析。激发光谱是荧光分析法进行定性和定量分析的基本参数，体现了引起荧光的激发辐射在不同波长的相对效率，化学物质的分子结构不同所吸收的激发光和发射的发射光波长及强弱均有差异。在荧光测定中，通常把激发光谱中，最长的峰值用于激发样品，这样可以避免较短的波长因具有较高的辐射能量而导致的样品光分解。
（2）荧光检测仪器构成：与紫外检测仪器类似，荧光检测仪器主要由光源、检测池、检测器、放大器和记录器等组成，只不过少了一个单色器这个部件。其中关键的部件仍然是光源，荧光检测器的激发光源一般要求比吸收测量中的光源具有更大的发射强度，用于波长范围宽。因此常常可选用卤钨灯、高压汞灯、氙弧灯作为光源。
（3）荧光光谱主要用于物质自身荧光的检测以及荧光探针与生物分子的相互作用检测。因此在这里我们来了解一下探针的概念。
①探针是在生物化学和分子生物学研究中用于指示特定的性质和物理状态的一类标记分子，根据标记和检测技术，可以分为放射性同位素标记探针、化学发光标记探针、比色法探针、荧光探针和酶标记探针。
②荧光探针具有检测灵敏度高、操作简便，对样品无损伤、可控、可重复使用、体外和体内皆可使用、可输出3D图像等优点。
③当生物大分子和化学小分子作用后，由于特异性结合使得结构或空间构象发生变化，可能会导致分子的荧光特性发生改变，利用这一作用特点，可以设计开发出检测生物大分子的荧光探针。在药物靶标功能研究疾病诊断等方面有重要的应用前景。
④比如这里显示了几种常见的荧光探针
（4）我们可以使用各种荧光光谱仪或者是多功能酶标仪进行荧光检测，而实时荧光定量PCR仪也可以检测荧光的激发光强度。当不需要进行定量而只是进行成像研究时，我们还可以荧光显微镜进行荧光探针的定位成像，使用荧光光谱检测试样时的基本注意事项和紫外吸收光谱是一样的。但是需要注意根据待测试样的性质，特别是光吸收性质选择适合的荧光探针分子，荧光检测得到的结果与紫外也很类似，也有单波长激发值和光谱图的两种形式。比如下面就是荧光滴定分析法的典型结果图
（5）荧光光谱的应用
荧光光谱可用于荧光物质的定性及定量测定、分子间相互作用研究。当酶促反应底物自身带荧光或外接荧光基团时，荧光光谱也可用于酶活力测定或者酶动力学研究、酶联免疫法实验。此外，由于绿色荧光蛋白（GFP）标记技术在生物学研究中广泛应用，荧光光谱也可用于GFP及其他荧光蛋白的定量检测。
